Ανάλυση λιπιδίων σε ζωντανά κύτταρα: Μια νέα ανακάλυψη στην υπερφασματική φωτοακουστική μικροσκοπία μεσαίου υπερύθρου

Τα λιπίδια δεν είναι μόνο δομικά συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών και μορίων αποθήκευσης ενέργειας, αλλά σχετίζονται επίσης στενά με την εμφάνιση και την ανάπτυξη καρκίνου, παχυσαρκίας, διαβήτη, καρδιαγγειακών παθήσεων και νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Ωστόσο, η άμεση παρατήρηση και διάκριση διαφορετικών τύπων λιπιδίων σε ζωντανά κύτταρα αντιμετωπίζει από καιρό τεχνικές προκλήσεις. Οι παραδοσιακές μέθοδοι σήμανσης με φθορισμό περιορίζονται από την αποτελεσματικότητα, την ειδικότητα και την πιθανή παρέμβαση στις κυτταρικές λειτουργίες, ενώ οι οπτικές τεχνικές χωρίς ετικέτα συχνά δυσκολεύονται να διακρίνουν μόρια λιπιδίων με παρόμοιες χημικές δομές.

Η Nature Methods δημοσίευσε μια μελέτη που εισάγει μια τεχνολογία που ονομάζεται «Hyperspectral Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy» (hyFOPM). Χρησιμοποιώντας τις λειτουργίες δόνησης ενός δεσμού στην περιοχή δακτυλικών αποτυπωμάτων μεσαίας υπέρυθρης ακτινοβολίας, αυτή η τεχνολογία επιτρέπει την ανίχνευση χωρίς ετικέτες και τη δυναμική απεικόνιση της σφιγγομυελίνης (SM) και της χοληστερόλης (Chol) σε ζωντανά κύτταρα.

Τεχνικές Αρχές
Οι περισσότερες οπτικές μέθοδοι χωρίς ετικέτα βασίζονται σε σήματα στην περιοχή δόνησης τάνυσης CH (περίπου 2800-3000 cm-1), αλλά οι φασματικές ζώνες σε αυτήν την περιοχή είναι πολύ παρόμοιες σε διάφορα λιπίδια, καθιστώντας δύσκολη τη διάκριση μεταξύ διαφορετικών τύπων. Αντίθετα, η περιοχή δακτυλικών αποτυπωμάτων μεσαίου υπέρυθρου (900–1730 cm-1) περιέχει περισσότερες πληροφορίες δόνησης ενός δεσμού που αντικατοπτρίζουν τη μοναδική δομή των μορίων, όπως η χαρακτηριστική απορρόφηση δεσμών αμιδίου, εστερικών δεσμών και στεροειδών δακτυλίων.

Ο σχεδιασμός του συστήματος hyFOPM επικεντρώνεται σε αυτήν την ιδέα. Χρησιμοποιεί ένα συντονιζόμενο κβαντικό καταρράκτη λέιζερ ως πηγή διέγερσης, που καλύπτει το εύρος 900–2932 cm-1 με φασματική ανάλυση 2 cm-1. Οι παλμοί λέιζερ διεγείρουν το δείγμα για να δημιουργήσουν φωτοακουστικά σήματα, τα οποία ανιχνεύονται από έναν μορφοτροπέα υπερήχων για την κατασκευή υπερφασματικών εικόνων. Το σύστημα έχει χωρική ανάλυση περίπου 4,3 μm, επιτρέποντας την απεικόνιση σε επίπεδο ζωντανών κυττάρων.

Επικύρωση Λιπιδικών Μοντέλων
Για να επαληθεύσει τη σκοπιμότητα της τεχνολογίας, η ερευνητική ομάδα ετοίμασε αρχικά μοντέλα δισδιάστατων λιπιδικών διαλυμάτων που περιέχουν χοληστερόλη (Chol), ακόρεστη φωσφατιδυλοχολίνη (DOPC) και σφιγγομυελίνη (SM).

(1)Σύγκριση φασματικών χαρακτηριστικών

Τα φάσματα της περιοχής δακτυλικών αποτυπωμάτων που συλλέγονται από το hyFOPM είναι πολύ συνεπή με τα αποτελέσματα ATR-FTIR. Τα τρία λιπίδια εμφανίζουν διακριτές φασματικές κορυφές: η χοληστερόλη παρουσιάζει ισχυρή κορυφή απορρόφησης για παραμόρφωση δακτυλίου στεροειδούς στα 1056 cm-1. Το DOPC διαθέτει δόνηση τάνυσης C=O της εστερικής ομάδας στα 1731 cm-1. και η σφιγγομυελίνη αντιστοιχεί στη λωρίδα αμιδίου Ι, στη ζώνη αμιδίου II και στη δόνηση κάμψης CH2 λιπαρού οξέος στα 1645 cm-1, 1555 cm-1, και 1464 cm-1, αντίστοιχα.

(2) Φασματική ικανότητα απομίμησης και ταξινόμησης
Όταν χρησιμοποιούνται μόνο 15 κυματοαριθμοί στην περιοχή των δακτυλικών αποτυπωμάτων για γραμμική απομίμηση, η αλληλεπίδραση μεταξύ χοληστερόλης και σφιγγομυελίνης είναι κοντά στο 0%, ενώ η διαφωνία για το DOPC είναι 23%. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση αυξάνεται σημαντικά όταν χρησιμοποιούνται 7 κυματοαριθμοί στην περιοχή τάνυσης CH. Περαιτέρω εφαρμογή της ανάλυσης γραμμικής διάκρισης (LDA) δείχνει ότι η μέση ακρίβεια ταξινόμησης φτάνει το 96% όταν χρησιμοποιείται είτε η περιοχή δακτυλικών αποτυπωμάτων είτε η περιοχή CH και φτάνει το 97% όταν χρησιμοποιούνται όλοι οι κυματοαριθμοί.

(3) Μοντέλα Giant Unilamellar Vesicle (GUV).
Η μελέτη προετοίμασε τρεις τύπους GUV για την προσομοίωση κυτταρικών μεμβρανών: Μοντέλο 1, ένα μείγμα 1:1 SM και Chol, που σχηματίζει μια πυκνή διατεταγμένη μεμβράνη. Μοντέλο 2, ένα μείγμα 2:2:1 από DOPC, SM και Chol, που συνυπάρχουν σε φάσεις διατάξεως υγρού και διαταραχής υγρού. και Μοντέλο 3, καθαρό DOPC, που σχηματίζει μια διαταραγμένη υγρή μεμβράνη. Οι εικόνες που λαμβάνονται από το hyFOPM στα 2852 cm-1 είναι μορφολογικά συνεπείς με εκείνες που λαμβάνονται με φθορίζουσα χρώση Ερυθρού του Νείλου. Τα φασματικά χαρακτηριστικά διαφορετικών κυστιδίων αντιστοιχούν σε καθαρά λιπίδια, επιβεβαιώνοντας ότι μπορούν να αναγνωριστούν μεμονωμένα συστατικά σε μικτές μεμβράνες.

(4)Εφαρμογές Ποιοτικού Ελέγχου
Εκτελώντας φασματικές μετρήσεις σε 10 διαφορετικά GUV για κάθε τύπο και σχεδιάζοντας διαγράμματα τριών φάσεων, η ερευνητική ομάδα διαπίστωσε ότι η πραγματική σύνθεση λιπιδίων παρέκκλινε από την αναλογία στόχο (απόκλιση περίπου 40%). Αυτό δείχνει ότι το hyFOPM μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αξιολόγηση ποιότητας στην προετοιμασία GUV.

Εφαρμογές σε Ζωντανά Κύτταρα
Η μελέτη εφάρμοσε περαιτέρω το hyFOPM σε ζωντανά κύτταρα, παρατηρώντας τις δυναμικές αλλαγές της σφιγγομυελίνης και της χοληστερόλης σε δύο μοντέλα κυττάρων, αντίστοιχα.

(1) Συσσώρευση σφιγγομυελίνης σε κύτταρα Α549
Ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (Α549) υποβλήθηκαν σε αγωγή με την αντικαρκινική ένωση 2-υδροξυελαϊκό οξύ (2-OHOA), η οποία αναμένεται να προκαλέσει τη συσσώρευση σφιγγομυελίνης. Τα φάσματα περιοχής δακτυλικών αποτυπωμάτων (1600-1400 cm-1) συλλέχθηκαν από 50 κύτταρα, δείχνοντας ότι η περιοχή κορυφής των 1464 cm-1 αυξήθηκε κατά 117% μετά τη θεραπεία, σε σύγκριση με μόνο 23% στην ομάδα ελέγχου κατά την ίδια περίοδο. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απεικόνιση σε 3000 κύτταρα χρησιμοποιώντας μόνο τέσσερις κυματοαριθμούς (2852 cm-1 για τα συνολικά λιπίδια, 1540 cm-1 για το αμίδιο πρωτεΐνης II, 1464 cm-1 για τη σφιγγομυελίνη και 1048 cm-1 για τη χοληστερόλη). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σήμα σφιγγομυελίνης συνέχισε να αυξάνεται στις 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία, ενώ το σήμα της χοληστερόλης δεν έδειξε σημαντική αλλαγή.

(2) Φόρτωση χοληστερόλης σε κύτταρα HEK
Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (HEK293) συνεπωάστηκαν με σύμπλοκο μεθυλ-β-κυκλοδεξτρίνης-χοληστερόλης (MβCD-Chol) για να αυξηθεί η χοληστερόλη στην κυτταρική μεμβράνη. Τα φάσματα της περιοχής δακτυλικών αποτυπωμάτων των 50 κυττάρων έδειξαν ότι η περιοχή κορυφής των 1048 cm-1 αυξήθηκε κατά 161% μετά τη θεραπεία, ενώ η κορυφή των 1464 cm-1 για τη σφιγγομυελίνη μειώθηκε ελαφρώς - σύμφωνα με τη γνωστή ιδιότητα ότι η κυκλοδεξτρίνη εκχυλίζει ορισμένα λιπίδια της μεμβράνης ενώ απελευθερώνει χοληστερόλη. Η απεικόνιση πολλαπλών κυμάτων 3000 κυττάρων επιβεβαίωσε περαιτέρω την αύξηση του σήματος της χοληστερόλης, με ελαφρά αύξηση στο συνολικό λιπιδικό σήμα και μικρή αλλαγή στο σήμα πρωτεΐνης.

Σημασία και προοπτική
Αυτή η μελέτη καταδεικνύει την ικανότητα διάκρισης μορίων λιπιδίων με παρόμοιες χημικές δομές σε ζωντανά κύτταρα χωρίς σήμανση. Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους που βασίζονται σε φθορίζουσα ή ισοτοπική επισήμανση, το hyFOPM αποφεύγει ζητήματα όπως η αποτελεσματικότητα της σήμανσης και η παρεμβολή στις κυτταρικές λειτουργίες και η επιλεκτικότητά του μπορεί να προσαρμοστεί ευέλικτα στα φασματικά χαρακτηριστικά των λιπιδίων-στόχων προσαρμόζοντας τους κυματοαριθμούς διέγερσης.

Η φασματική εξειδίκευση του τρέχοντος συστήματος στην περιοχή των δακτυλικών αποτυπωμάτων είναι ανώτερη από αυτή της περιοχής τάνυσης CH, γεγονός που ανοίγει δυνατότητες διάκρισης περισσότερων υποτύπων λιπιδίων. Η μελέτη επισημαίνει επίσης ότι ο συνδυασμός προηγμένων τεχνικών φασματικής απομίμησης, όπως η βαθιά μάθηση, αναμένεται να βελτιώσει περαιτέρω την ευαισθησία και την ειδικότητα. Επιπλέον, η φωτοακουστική μικροσκοπία μεσαίας υπέρυθρης ακτινοβολίας μπορεί να φτάσει σε βάθος απεικόνισης άνω των 150 μm στον ιστό και οι μελλοντικές εφαρμογές μπορούν να επεκταθούν σε παχιά δείγματα ή σε ρυθμίσεις in vivo. Η τεχνολογική επιτάχυνση (π.χ. φασματική υποδειγματοληψία) και η σμίκρυνση του συστήματος είναι σημαντικές κατευθύνσεις για την προώθηση αυτής της τεχνολογίας προς την ανάλυση σημείου φροντίδας ή τις συνήθεις εργαστηριακές δοκιμές.